聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是现代分子生物学中一项革命性的技术，它极大地推动了基因工程、遗传学研究和生物技术的发展，广泛应用于基因克隆、基因表达分析、遗传疾病诊断、法医学鉴定等领域。PCR技术被美国《Science》杂志列为十余项重大科学发明之首，PCR技术的发明者Kary Mullis也因此荣获1993年诺贝尔化学奖。
1. PCR技术概要
PCR技术是一种在体外快速扩增特定DNA片段的方法，它可以从极少量的DNA模板出发，通过特定的循环反应过程，高效地合成大量目标DNA。PCR由高温变性、低温退火、适温延伸等反应组成1个周期，循环多次，使目的DNA得以迅速扩增。
图1. PCR原理图
2. PCR原理
PCR技术的核心原理是模拟DNA在细胞内的复制过程。通过温度的变化，实现DNA双链的变性、引物的退火以及新链的延伸。具体来说，PCR包括以下三个主要步骤：
2.1 变性（Denaturation）：在高温（通常为94 - 98°C）下，DNA双链被解开成为单链。
2.2 退火（Annealing）：降低温度（通常为50 - 65°C），使特定的引物与目标DNA序列互补结合。
2.3 延伸（Extension）：温度再次提升至72°C，DNA聚合酶沿着引物方向开始合成新的DNA链。
这三个步骤构成一个循环，每个循环都会使目标DNA的数量翻倍，经过多个循环后，可以获得大量的目标DNA片段。
图2. PCR反应步骤
3. PCR反应要素
PCR反应的成功与否在很大程度上取决于其核心要素的精确配置和优化。为了成功进行PCR反应，以下几个要素必不可少：
3.1 模板DNA：模板DNA是PCR反应的基础，它提供了目标DNA序列的初始拷贝。在PCR过程中，模板DNA的质量、纯度和浓度都至关重要。
表1. 模板DNA类型及获取方式
| 模板类型 | 获取方式 | 纯度 | 储存温度 |
| cDNA | 逆转录 | 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制剂、DNA 结合蛋白等 | - 20 / - 80 ℃ |
| gDNA（基因组DNA）、λ DNA | DNA 提取 | ||
| 质粒DNA | 质粒提取 | ||
| 裂解产物 | 样品裂解 |
3.2 引物：引物是短的单链DNA片段，它们在PCR反应中起到至关重要的作用。引物的设计需要考虑其长度、熔解温度（Tm）、GC含量以及避免二级结构和非特异性结合。引物的特异性决定了PCR产物的准确性，引物设计需要考虑长度、熔解温度(Tm)、GC含量、与模板序列结合的特异性，引物自身要避免形成二级结构。引物的特异性决定了PCR扩增产物的准确性。
图3. PCR引物作用示意图
3.3 DNA聚合酶：DNA聚合酶是PCR反应中负责合成新DNA链的关键酶。选择合适的聚合酶对于提高PCR产物的质量和特异性至关重要。
表2. 不同种类DNA聚合酶活性
| 活性 | Taq酶 | 高保真酶 | Bst 酶 |
| 5’ - 3’ 聚合活性 | √ | √ | √ |
| 5’ - 3’ 外切活性（切除修复作用） | √ | ||
| 3’ - 5’ 外切活性（校对活性） | √ | ||
| 链置换活性 | √ |
3.4 四种脱氧核苷酸（dNTPs）：dNTPs是构成新DNA链的基本单元，包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP。它们的浓度和质量直接影响PCR反应的效率和产物的特异性。
3.5 缓冲液（buffer）：缓冲液为PCR反应提供了适宜的化学环境，维持反应的pH稳定，并提供必要的离子和辅助因子。常见的PCR缓冲液包含Mg2+、K+、Tris-HCl和（NH4）2SO4等成分。Mg2+的浓度对聚合酶的活性和引物的退火尤为重要。
3.6 增强剂：增强剂如DMSO、甘油、BSA等，可以在特定情况下提高PCR反应的特异性和效率。
3.7 循环数：循环数是影响PCR扩增产量的重要因素，一般PCR循环数为25-35 cycles。模板初始浓度低，可增加循环数以提高扩增产量。但循环数一般不建议超过35 cycles，若循环数过多，可能产生非特异性扩增产物。图4展示了特异性扩增与非特异性扩增电泳图，其中①为特异性扩增,②和③均为非特异性扩增。
图4. 特异性扩增与非特异性扩增对比
4. PCR方法介绍
随着PCR技术的发展，出现了多种PCR方法，以适应不同的实验需求和目的：
4.1 降落 PCR（ Touchdown PCR, TD-PCR）：一种优化的PCR技术，通过逐步降低退火温度来提高引物特异性和扩增效率。在TD-PCR中，初始退火温度设定高于目标Tm值，随着循环次数增加，退火温度逐渐降至低于Tm值。这种方法有助于筛选出最特异性的引物，减少非特异性结合，提高PCR产物的纯度。TD-PCR特别适用于扩增复杂基因组中的特定序列，或在多序列环境中进行精确扩增。通过这种方法，可以获得高质量的PCR产物，广泛应用于分子生物学研究和诊断测试中。
4.2 巢式PCR（Nested PCR）：一种提高PCR特异性和灵敏度的技术，通过两轮扩增过程来获得目标DNA片段。在第一轮扩增中，使用一对外部引物（outer primers）对原始模板DNA进行扩增，产生一个较大的目标区域。随后，取少量第一轮产物作为模板进行第二轮扩增，这次使用一对新的内部引物（inner primers），它们设计在第一轮产物的内部区域，从而实现对目标序列的精确扩增。巢式PCR的优势在于能够显著减少非特异性扩增和污染，同时提高对低丰度目标DNA的检测能力。这种方法在基因克隆、突变检测和稀有序列的扩增中应用较多。
图5. 巢式PCR扩增流程
4.3 多重PCR（Multiplex PCR）：一种在单一反应管中同时扩增多个DNA目标序列的技术。通过设计多对特异性引物，每对引物针对不同的目标序列，这些引物在相同的反应条件下工作，允许同时进行多个PCR扩增。这种方法的优势在于能够提高效率和节省资源，因为它允许一次实验检测多个遗传标记或病原体。多重PCR在临床诊断、遗传疾病筛查、基因型分析和复杂样本的多重检测中具有广泛应用。
图6. 多重PCR扩增示意图
4.4 重叠延伸PCR（Overlap Extension PCR，OE-PCR）：一种用于连接两个或多个DNA片段的分子克隆技术。这种方法是利用未端互补的引物，使PCR产物形成重叠链:针对Gene A和Gene B分别设计扩增引物，Gene A的反向引物(Rm)3’端带有Gene B 5’端的一段序列，Gene B 正向引物（Fm）5'端带有Gene A 3'端的一段序列，一轮PCR扩增出的产物会各自带有一段同源区域，在二轮PCR反应中，带有同源区域的两个PCR产物，可以通过同源区域实观无缝拼接。OE-PCR广泛应用于基因构建、定向突变生成以及复杂基因组结构的组装。
图7. 重叠延伸PCR扩增示意图
4.5 直扩PCR（Direct PCR）：一种简化的PCR技术，它允许直接从细胞或组织样本中进行DNA扩增，无需进行传统的DNA提取步骤。这种方法通过使用特殊的缓冲液或酶处理来破坏细胞膜和释放DNA，从而使DNA直接暴露于PCR反应体系中。直扩PCR减少了样本处理的步骤和时间，提高了实验的效率和便捷性。它特别适用于快速检测、现场采样分析和当样本量有限时的DNA扩增。
图8. 直扩PCR反应示意图